[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及麦冬皂苷D应用，具体地说，涉及麦冬皂苷D在银屑病治疗中的应用。

[0002] 银屑病是一种由免疫介导的常见慢性炎症性皮肤疾病，其发病与遗传和环境等多种因素相关。除皮肤受累外，银屑病也会累及关节等处，给患者的健康带来巨大的危害。表皮细胞过度增殖和炎症细胞和炎性介质浸润是银屑病主要的病理表现。KLF3是转录因子KLF家族的成员，参与脂肪和红细胞生成、B细胞发育及肌肉和神经系统功能调节等多种生理病理过程，并与多种肿瘤的发生发展相关。既往的研究表明，KLF3通过激活WNT/β‑Catenin信号通路促进胃癌细胞增殖、迁移和侵袭；在肾脏中，KLF3通过激活STAT3通路，促进细胞增殖，加重糖尿病肾病的炎症反应；在皮肤中，KLF3促进角质形成细胞分化基因的表达，提示KLF3或可通过促进角质形成细胞的增殖和炎症加重银屑病，但目前尚无KLF3在银屑病中作用的报道。麦冬皂苷D是从麦冬块茎中分离的，一种罕见的天然存在的C29甾体糖苷，具有抗炎、抗氧化和抗癌活性。有研究表明麦冬皂苷D能与KLF3结合并抑制KLF3的功能，促进血管生成及新生骨形成，对骨质疏松模型的小鼠具有潜在治疗价值。但其在银屑病的作用及其机制尚无相关探索。

[0019] 为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，如下结合具体实施例对本发明做进一步说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。

[0020] 一、实验方法。

[0021] 1. 细胞：HaCat角质形成细胞（购买于中国科学院细胞库）用添加10% FBS与1%青/链霉素抗生素的DMEM高糖培养基培养于37℃，5% CO2恒温培养箱中。待细胞长至密度70‑90%时，使用胰酶进行37℃消化，并以1:3比例传代或按照相应要求数量铺板，用于后续实验。麦冬皂苷D（购买于MCE公司），用DMSO溶解，以125nM，250nM的浓度添加到细胞中培养5小时后进行后续实验。

[0022] 2. 细胞蛋白提取及蛋白免疫印记：六孔板的每个孔中加入新鲜配置的RIPA裂解液60μL，包含58.8μL RIPA（强）裂解液，0.6μL 100X蛋白酶抑制剂和0.6μL PMSF。于冰上裂解10分钟，然后用预冷的细胞刮刮取样本于1.5mL EP管中。后于4℃，15000rpm离心15分钟，小心吸取上清，并转移入新的预冷1.5mL EP管中，即得到蛋白样本。蛋白质样本使用BCA标准曲线法进行定量，调整浓度后分装冷冻于‑80℃。使用伯乐SDS‑PAGE凝胶配置试剂盒配置western blot检测用凝胶，具体为（每块凝胶）：分别按照1:1比例混合分离胶A，B液与浓缩胶A，B液（分离胶共6mL，浓缩胶共2mL），向分离胶与浓缩胶内分别加入TEMED 6μL与4μL，混匀后放置于阴凉避光处静置排气10分钟。期间，组装垂直凝胶制作相关器材备用。待排气完毕，分别向分离胶和浓缩胶中加入30μL与10μL 30%过硫酸铵，轻柔吹打混匀后立刻依次灌胶于凝胶玻璃槽内（分离胶在下，浓缩胶在上），随后缓慢插入1.0mm样品梳，于室温静置30分钟，待凝胶完全凝固后拆下玻璃板，自来水冲洗表面残胶，并浸泡于去离子水中，4℃储存备用。

[0023] 安装垂直电泳设备和SDS‑PAGE凝胶，向电泳槽内倒入1L新鲜配置的电泳缓冲液（14.4g甘氨酸，3.03g Tris，1g SDS，去离子水定容至1000mL），小心拔去样品梳，并用移液器轻柔吹打样品孔，排出气泡与残胶。将上述实验提取的蛋白质溶液混合5×SDS上样缓冲液（4:1），99℃加热10分钟使蛋白质变性。随后按照每样品孔20μg蛋白质进行点样，同时加入6μL预染蛋白质分子量标记蛋白，以140V恒压电泳60分钟。待蛋白质样品充分分离后，拆除垂直电泳槽，切割SDS‑PAGE凝胶，并移入蛋白转印槽中。转印槽安装顺序为（由下向上）：海绵垫‑加厚滤纸‑凝胶‑PVDF膜（0.45μm，预先甲醇激活）‑加厚滤纸‑海绵垫。向转印槽内倒入新鲜配置的电转缓冲液（14.4g甘氨酸，3.03g Tris，200mL甲醇，去离子水定容至1000mL）
1L，并将转印槽埋置于冰内，以300mA恒流转印48分钟。

[0024] 待转印结束，拆除转印装置，按照待测蛋白质分子量切割PVDF膜，TBST冲洗，并用5%脱脂牛奶室温封闭2个小时。封闭完成后，TBST冲洗PVDF膜10分钟，添加以一抗稀释液配置的一抗于对应PVDF膜上，置于4℃水平摇床缓慢摇晃孵育过夜。第二日，回收一抗，TBST冲洗PVDF膜3次，每次10分钟。随后加入TBST配置的二抗，于室温摇晃孵育2个小时，TBST冲洗PVDF膜3次，每次10分钟。洗涤完毕后将PVDF膜浸泡于新的TBST溶液中待用。

[0025] 等比例混合ECL发光液A液与B液配置ECL显影液并避光备用。将PVDF膜取出，吸水纸吸干，并放置于凝胶成像仪中，滴加少许ECL显影液于PVDF膜表面，使得膜恰好被显影液浸润。更改成像仪为化学发光（CL）模式，曝光观察结果，判断相应蛋白质表达水平。

[0026] 3. 小鼠模型：6‑8周龄C57BL/6小鼠随机分组为对照组和实验组，对照组6只，实验组7只。每只小鼠均剃掉背部皮肤，面积为2厘米*3厘米。对照组应用62.5mg咪喹莫特乳膏涂抹于小鼠背部皮肤，连续涂抹7天。实验组应用62.5mg咪喹莫特乳膏及20μL、总量为10μM的麦冬皂苷D涂抹于小鼠背部皮肤，连续涂抹7天。

[0027] 4. HE染色：小鼠背部皮肤组织取材后浸入组织固定液，隔日进行石蜡包埋处理。在切片机上固定包埋好的蜡块，进行连续切片，将切片贴附于载玻片上。将石蜡切片放置在
65℃烘箱内烘烤2小时后，依次将切片放入二甲苯（2次，每次15分钟），无水乙醇（2次，每次
10分钟），95%酒精5分钟，85%酒精5分钟，75%酒精5分钟，双蒸水洗3分钟。随后将切片入苏木素染3分钟，自来水冲洗10分钟。切片入伊红染液中染色3min，自来水洗10分钟。将切片依次放入75%酒精1分钟，85%酒精1分钟，95%酒精1分钟，无水乙醇（2次，每次5分钟），二甲苯（两次，每次10分钟）中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，用中性树胶封片。随后于显微镜下进行图像采集和分析。

[0028] 5. 免疫组化：小鼠背部皮肤组织取材后浸入组织固定液，隔日进行石蜡包埋处理。在切片机上固定包埋好的蜡块，进行连续切片，将切片贴附于载玻片上。将石蜡切片放置在65℃烘箱内烘烤2小时后，依次将切片放入二甲苯（2次，每次15分钟），无水乙醇（2次，每次10分钟），95%酒精5分钟，85%酒精5分钟，75%酒精5分钟，双蒸水洗3分钟。随后将组织切片浸入有柠檬酸抗原修复缓冲液的修复盒中，置于高压锅进行高压水浴。煮沸后再持续加热2分钟。在此过程中，应防止缓冲液过度蒸发，并且不应对切片进行干燥。冷却后，将载玻片置于PBS（pH 7.4）中，并在脱色振荡器上用PBS振摇洗涤3次，每次3分钟。

[0029] 用免疫组化笔将组织圈起以防止抗体流走，滴加内源性过氧化物酶阻断剂于圆圈中，在室温下孵育15分钟。PBS洗涤3次，每次3分钟。滴加非特异性染色阻断剂，室温孵育15分钟后，用干净的吸水纸小心吸净切片上的阻断剂，并向切片上滴加一定比例一抗，将切片平放在潮湿的盒子中防止抗体蒸发，并在4℃下孵育过夜。次日将湿盒置于室温30分钟后，将载玻片放入PBS震荡洗涤3次，每次3分钟。随后将生物素标记的羊抗小鼠/兔IgG聚合物滴加于切片上，37℃孵育15分钟。PBS振摇洗涤3次，每次3分钟。滴加链霉菌抗生素蛋白‑过氧化物酶，在37℃孵育15分钟后PBS洗涤3次，每次3分钟。将DAB显色试剂按比例混合为工作液，滴加到圈中并在显微镜下观察，注意控制显色时间。棕黄色是阳性染色，待颜色加深时用自来水冲洗切片以终止反应。用苏木精复染20秒，在自来水中冲洗10分钟。最后将切片依次置于75%、85%、95%酒精中各1分钟，无水乙醇（2次，每次5分钟），二甲苯（2次，每次10分钟），直到脱水并变成透明，取出切片用中性树胶封片。随后于显微镜下进行图像采集和分析。

[0030] 二、实验结果。

[0031] 图1可见，在IL‑17A存在的情况下，经麦冬皂苷D作用后的角质形成细胞中KLF3蛋白质表达减少。

[0032] 图2可见，与对照组相比，经麦冬皂苷D外用治疗的小鼠背部银屑病皮损处KLF3表达减少。

[0033] 图3可见，与对照组相比，经麦冬皂苷D外用治疗的小鼠背部银屑病皮损减轻，褶皱及鳞屑减少。

[0034] 图4可见，与对照组相比，经麦冬皂苷D外用治疗的小鼠背部银屑病皮损处表皮增厚情况明显减轻。

[0035] 综上所述，本发明通过筛选出一种抑制KLF3表达的小分子化合物，在角质形成细胞上验证了该化合物可以抑制KLF3的表达，并且该化合物作用于小鼠皮肤上可以缓解银屑病的皮损。

[0036] 以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。