[0001] 本申请涉及微生物领域，涉及一种海洋杆菌，具体地说是一种海洋杆菌(Pelagibacterium sp.Fum‑5)在降解呕吐毒素方面的应用。

[0002] 脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)又称呕吐毒素，其结构为四环的倍半萜，化学名为3α，7α，15‑三羟基‑12，13‑环氧单端孢霉‑9烯‑8酮，属于B族单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、粉红镰刀菌(Fusarium roseum)、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)等真菌在适宜条件下产生的水溶性次级代谢产物，是一种污染最广泛、最常见的真菌毒素。无色针状结晶，易溶于水、乙醇等溶剂；热稳定性高，DON在120℃下稳定，在180℃下中等稳定，在210℃下部分稳定；具有较强的耐酸性，但对碱性环境比较敏感。呕吐毒素污染小麦、大麦、玉米和大米等谷物及其制品，牛奶及其制品和啤酒等食品，以谷物污染最为严重，不仅造成农作物减产，营养价值降低，而且会随着食物链传递，严重危害人畜健康。呕吐毒素对人类和动物存在广泛的毒性效应，能严重损伤机体的免疫系统；高剂量的呕吐毒素能够严重损伤淋巴结、脾脏等免疫器官，诱导白细胞的凋亡，导致白细胞数量降低，引起免疫抑制。因此，开展呕吐毒素脱除与阻控技术的研究，解决毒素对粮食和饲料的污染，对改善动物生产性能、保护人们“舌尖上的安全”以及保障国家食品安全具有非常重要的意义。

[0003] 目前，真菌毒素的脱毒方法主要包括物理、化学和生物脱毒法。虽然物理、化学脱毒法取得了一定程度上的成功，但存在操作困难、脱毒效率低、降低营养品质和适口性等缺点，实际应用上具有一定的局限性。而且目前常用的吸附剂普遍对呕吐毒素的吸附效果差，脱除率最高仅达到30％，呕吐毒素污染成为养殖行业面临的难题。呕吐毒素的毒性作用与C12，13‑环氧结构，C9，10位的双键结构，及C‑3位上的羟基密切相关，生物脱毒法是利用微生物细胞内合成的生物酶破坏其毒性基团，将其分子结构转化成无毒或低毒产物，具有作用条件温和，特异性强，降解效果高，对原料的感官性状、适口性等影响极小等优点，被认为是最佳脱毒方法。而目前已报道的降解呕吐毒素的菌株较少，降解效率低,降解能力弱。因此，亟需发掘高效、安全、特异性高效降解呕吐毒素的微生物菌株。

[0015] 为了能够更清楚地理解本申请的上述目的、特征和优点，下面结合附图说明根据本申请的具体实施方式。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

[0016] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本申请，但是，本申请还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本申请的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。

[0017] 下面结合附图描述本申请的一些实施例。

[0018] 本申请公开了一种海洋杆菌(Pelagibacterium sp.Fum‑5)在降解呕吐毒素方面的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本申请中。本申请的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本申请内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本申请技术。

[0019] 如无特别声明，本申请中所用原料及试剂均可由市场购得。

[0020] 实施例1菌株的筛选

[0021] 本申请从北京延庆胡家营地区采集的土壤中进行分离筛选，从家禽养殖场周边的土壤样品筛选出该菌株。

[0022] (1)取10g土壤样品于250mL锥形瓶中，加入100mL生理盐水，30℃、180rpm振荡30min，静置30‑60s；

[0023] (2)取1mL上层菌液加入至含10mg/L的伏马毒素的富集培养基(MM培养基)中，30℃、200rpm富集培养7d；

[0024] 其中，MM培养基的配方为：取1.6g Na2HPO4、1.0g KH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.5g NaNO3、0.5g(NH4)2SO4、0.025g CaCl2·7H2O及1L蒸馏水，充分溶解，高压灭菌后加入2mL微量元素溶液，以及伏马毒素，伏马毒素为唯一碳源。

[0025] 其中，微量元素溶液的配方为：1.5g FeCl2·4H2O、0.19gCoCl2·6H2O、0.1g MnCl2·4H2O、0.07g ZnCl2、0.062g H3BO3、0.036g Na2MoO4·2H2O、0.024g NiCl2·6H2O、0.017g CuCl2·2H2O、0.01gAlK(SO4)2·12H2O及1L蒸馏水，充分溶解，灭菌后备用。

[0026] (3)取1mL富集培养后的菌液加入至含20mg/L的伏马毒素的MM培养基中，30℃、200rpm第二次富集培养7d；

[0027] (4)将第二次富集培养后的菌液稀释至10‑3、10‑4、10‑5倍，涂布于LB固体培养基上，30℃培养24‑48h；

[0028] 其中，LB固体培养基的配方为：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠、15g琼脂及1L蒸馏水，充分溶解，灭菌后备用。

[0029] (5)选择菌落生长密度适中的平板，挑取平板上菌落形态不一致的菌株接种于至LB液体培养基中，30℃、200rpm培养16h，然后以1％接种量转接于含10mg/L的伏马毒素的MM培养基中，30℃、200rpm培养12h，得到候选伏马毒素降解菌株；

[0030] 其中，LB液体培养基的配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1L。

[0031] (6)对所有候选伏马毒素降解菌株进行筛选，检测其伏马毒素B1降解效率，筛选得到降解效率最高的菌株，命名Fum‑5，将菌株海洋杆菌Fum‑5于‑80℃甘油管中保存，备用。

[0032] 实施例2菌株的鉴定

[0033] 将15％甘油保存的菌株Fum‑5用平板划线法接种于LB固体培养基上活化后，于30℃培养36‑48h后，观察菌落的形态特征，菌株Fum‑5菌落呈乳白色不透明，表面光滑，边缘平整，单菌落为圆形，该菌株的扫描电镜照片(20000×)为图1，透射电镜照片为图2。

[0034] 对降解效率高的菌株进行16S rDNA基因序列测定，并对扩增产物进行测序，将测序结果进行BLAST比对，并采用临近法构建其系统发育树，对菌种进行鉴定。

[0035] (1)鉴定结果：使用通用引物27F/1492R扩增16S rDNA基因片段，并对扩增产物进行测序，得到该菌株的16S rDNA序列SEQ ID NO:1，经过序列对比，该菌株Fum‑5属于海洋杆菌(Pelagibacterium sp.)，其系统发育树见图3。

[0036] (2)形态观察：用革兰氏染色，经光学显微镜(莱卡)观察其形态，如图3所示。菌株Fum‑5属于革兰氏阴性菌，呈短杆状。

[0037] 申请人将海洋杆菌Fum‑5(Pelagibacterium sp.Fum‑5)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间2022年12月30日，保藏编号CGMCC No.26300，保藏地址北京是朝阳区北辰西路1号院3号。

[0038] 实施例3海洋杆菌Fum‑5对呕吐毒素的降解作用

[0039] 1.DON测定方法

[0040] 采用HPLC(柱前化学衍生)检测呕吐毒素，条件如下：

[0041] 流动相：A相：水B相：甲醇。等度洗脱，20％B；

[0042] 色谱柱：C18色谱柱：250mm×4.6mm,5μm；

[0043] 流动相流速：1.0mL/min；

[0044] 检测波长：紫外检测器，波长218nm；

[0045] 柱温：40℃；

[0046] 进样量：20μL。

[0047] 2.海洋杆菌Fum‑5对DON的降解

[0048] (1)将海洋杆菌Fum‑5接种于LB液体培养中，30℃，200rpm培养48h，制备菌液；

[0049] 将10mg DON标准品溶解于10mL 50％(v/v)乙腈中，获得浓度为1000mg/L DON溶液；

[0050] 取1mL步骤(1)制备的菌液，置于2mL离心管中，向管中加入10μL步骤(2)制备的DON溶液，充分振荡混匀后，30℃，140rpm振荡孵育8h，12000rpm离心10min并收集上清，得到实验组溶液；

[0051] 取1mL LB液体培养基，置于2mL离心管中，向管中加入10μL步骤(2)制备的DON溶液，充分振荡混匀后，30℃，140rpm振荡孵育24h，12000rpm离心10min并收集上清，得到对照组溶液；

[0052] 对实验组溶液和对照组溶液分别作为待测溶液，进行如下操作：

[0053] ①取上清液0.8mL，加入4倍体积PBS溶液混匀，取混匀后的液体1mL，上样至免疫亲和柱，控制流速在1～3mL/min；用10mL PBS溶液以同样流速淋洗免疫亲和柱。

[0054] ②分别用1mL甲醇溶液洗脱免疫亲和柱2次，收集洗脱液；55℃氮气吹干，加入1mL甲醇‑水(20+80)溶解沉淀，涡旋30s；过0.2μm PTFE滤膜，收集液体于2mL进样小瓶中，得到样品液。

[0055] ③取步骤②得到的样品液，用HPLC(柱前化学衍生)进行检测。

[0056] (2)DON降解率(％)＝(对照组剩余DON含量‑实验组剩余DON含量)/对照组剩余DON含量×100。

[0057] (3)结果发现：

[0058] 实验重复四次，结果取平均值。

[0059] 检测结果如图4所示，A为DON标准品(DON保留时间为9.883min)；B为对照组(DON保留时间为9.818min)。

[0060] 对照组残留DON含量为10mg/L。

[0061] 实验组残留DON含量为0mg/L。

[0062] 结果表明，海洋杆菌Fum‑5对DON有较好的降解效果，降解率为100％。

[0063] 实施例4降解呕吐毒素的食品或饲料添加剂及其制备方法

[0064] 使用生理上可接受的载体与海洋杆菌Fum‑5混合，得到食品或饲料添加剂。生理上可接受的载体选自麦芽糖糊精、奶粉、环糊精、蔗糖、淀粉、小麦、麦麸、米糠、稻米、石灰石、滑石粉或蒙脱石等的一种或多种。

[0065] 将麦麸和米糠按质量比4:1比例混合(占添加剂总质量90％)，然后将前述载体混合物与海洋杆菌Fum‑5按质量比9:1比例混合，充分搅拌使载体和海洋杆菌Fum‑5混合均匀，得到可以降解呕吐毒素的添加剂。

[0066] 实施例5海洋杆菌Fum‑5在降解呕吐毒素方面的应用

[0067] 在玉米青贮饲料开窖后，以10g/t的比例添加实施例4中的饲料添加剂，充分搅拌后堆料2‑3天，实现降解饲料中呕吐毒素的目的。在混合后监控堆料的温度，维持在30°左右。若温度过低，应适当提高堆料的体积。若温度过高，则应进行适当翻料或搅拌。

[0068] 经检测，堆料后呕吐毒素的含量低于1mg/kg，符合国家标准。

[0069] 本文应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上所述仅为本申请的优选实施例，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。