[0001] 本发明涉及生物发酵工业技术领域，特指一种含有高生物量的富硒酵母，其生产方法及含有其的添加剂和预混料。

[0002] 内起着平衡氧化还原氛围，增强免疫力，在预防和治疗糖尿病、白内障、心脑血管疾病、克山病、大骨节病、关节炎和类风湿关节炎等疾病，预防动物白肌病等方面发挥着重要的作用。目前，中国营养学会推荐的成人摄入量为每日50-250微克，而我国2/3地区硒摄入量低于最低推荐值。缺硒也已成为世界性的畜牧业问题，迄今人们发现约有40种动物具有硒缺乏病。各种动物特别是幼畜、幼禽均可发生，山羊羔的发病率可达90%以上，死亡率也很高。目前在中国仍然以无机硒的形式增加微量元素硒的含量，主要是亚硒酸钠。然而无机硒有较大的毒性，且不易被吸收，不适合人和动物使用。日本等国政府已明令禁止在所有食品、动物饲料中使用亚硒酸钠等无机硒。富硒酵母是利用酵母开发出来的一种有机硒源，它是通过硒富集在酵母细胞蛋白结构内生产的，富硒酵母已证明远比亚硒酸钠安全、稳定、易吸收,并具有多方面的保健功能，故近几年来在人和动物保健和治疗中的应用日趋广泛。

[0003] 酿酒酵母菌的亚种布拉氏酵母，具有抗微生物和抗毒素作用，并对肠粘膜有营养作用。这种酵母菌不会被胃肠液、抗菌素或磺胺类药物所破坏，在肠内具有活性作用。在动物试验中，药理学研究表明：无论在体外或体内，该药具有抗菌(包括白色念珠菌)作用。当在动物中诱发实验性感染时，它可促进动物体内的免疫作用。它能合成维生素B，如维生素B1，维生素B2，维生素B6，泛酸，烟酸。此外，还能显著增加人与动物上皮细胞刷状缘内的二糖酶。由于以上优点，这种酵母已广泛用于治疗人和动物腹泻中。

[0022] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0023] 实施例1 低浓度亚硒酸钠平板筛选本发明采用酵母菌对亚硒酸钠的耐受性测定作为筛选方法，开展了本实验室保藏的多株酵母菌对硒的耐受性（50、100、300、500 µg/mL）研究，结果显示不同酵母菌株对亚硒酸钠的耐受性差异较大。分别在含有50、100、300、500 µg/mL的无机硒平板上用灭菌牙签点上备选酵母菌株，30℃静置培养48小时后，选择出在含有无机硒的平板上生长情况较好的8株菌（酿酒酵母S4、酿酒酵母S3、酿酒酵母S2、布拉氏酵母YBN-3、布拉氏酵母YBN-2、布拉氏酵母YBN-1、产烷假丝酵母C、布拉氏酵母B）进行进一步驯化研究（图1）。

[0024] 实施例2 高浓度亚硒酸钠平板驯化对筛选出的8株菌进一步在高浓度亚硒酸钠（1000、2000、3000 µg/mL）平板上驯化。分别在含有1000、2000、3000 µg/mL亚硒酸钠的平板上用灭菌牙签点上实施例1筛选出的酵母菌，30℃静置培养48小时后，选择在3000 µg/mL的高亚硒酸钠平板上生长情况良好的布拉氏酿酒酵母YBN-2作为生产菌株进行下一步实验（图2）。

[0025] 将筛选出的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）亚种布拉氏酵母命名为YBN-2，于2013年11月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.8447。

[0026] 实施例3富硒酵母发酵条件优化1、不同培养基的影响
将布拉氏酵母菌株分别用YPD与糖蜜培养基发酵培养，无机硒添加量为30µg/mL，装液量50和100mL，结果见表1。不同培养基对布拉氏酿酒酵母的生物量和硒含量有一定的影响。由表1可知，50和100mL糖蜜发酵培养基中培养的菌株生物量及有机硒含量均比YEPD培养基高。且与YEPD培养基比较，糖蜜培养基易保存，成本低廉，使用方便，适合工业化生产，因此选择以糖蜜为碳源进行下一步发酵条件优化。

[0027] 表1 不同发酵培养基对布拉氏酵母生物量及硒含量的影响2、发酵培养基氮源优化
不同氮源对布拉氏酵母的生物量和硒含量有一定的影响。以硫酸铵、尿素和玉米浆为氮源，通过发酵培养后生物量的对比，以0.5%尿素作为氮源，发酵培养生物量较高，因此确定0.5%尿素作为氮源。

[0028] 表2 不同氮源对布拉氏酵母生物量的影响3、硒母液的添加时间优化
无机硒的添加时间及添加量对布拉氏酵母生物量和硒含量有一定的影响。表3显示，在发酵开始和2 h后添加无机硒所得生物量均较高，因此无机硒的添加时间可以为发酵起始之时即0 h。

[0029] 表3 无机硒添加时间和添加量对布拉氏酵母生物量的影响综上所述，发酵培养条件优化结果为：以糖蜜培养基为发酵培养基，氮源为0.5%尿素，发酵开始即加入无机硒母液。拟将以上摇瓶发酵条件作为5升发酵罐小试实验基本发酵条件。

[0030] 实施例4 5L发酵罐发酵条件优化挑取一环布拉氏酵母接入装有300 mL YPD培养基的1000mL三角瓶中，30℃振荡培养
24小时。10-15%接种量接种于装有3L糖蜜培养基（糖蜜4%，氮源0.5%，亚硒酸钠100 μg/mL，pH5.5）的5L发酵罐中，通气搅拌32小时，维持溶氧大于20%，流加糖蜜和氨水补充碳氮源。发酵前24小时，每隔4小时测定菌体湿重，24-32小时，每隔2小时测定一次菌湿重（图
3）。发酵结束后，离心收集菌体，真空冷冻干燥后，测定样品活菌数、有机硒和无机硒含量，
10
活菌数为6.58×10 CFU/g，有机硒含量为3246.4μg/g，无机硒含量为213.14μg/g。

[0031] 实施例5 20L发酵罐发酵条件优化挑取布拉氏酵母接入8瓶装有200 mL YPD培养基的500mL三角瓶中，30℃振荡培养24小时，10-15%接种量接种于装有12L糖蜜培养基（糖蜜4%，氮源0.5%，亚硒酸钠100 μg/mL，pH5.5）的20L发酵罐中，通气搅拌48小时，流加糖蜜和氨水补充碳氮源。每隔8小时测菌体湿重。发酵24小时和48小时，取样品测定活菌数、干燥样品的有机硒和无机硒含量，发酵上清的有机硒和无机硒含量。测定结果显示，48小时内，菌体湿重一直在持续增长。发酵24小
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时，样品湿重140 g/L，活菌数2.2×10CFU/g，干燥菌体样品的有机硒含量是1981.22μg/g，无机硒含量是50.83μg/g，发酵上清有机硒含量是78.98μg/g，无机硒含量56.32μg/
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g。发酵48小时，样品湿重220 g/L，活菌数5.2×10 CFU/g，干燥菌体样品的有机硒含量是3015.22μg/g，无机硒含量是568.24μg/g，发酵上清有机硒含量是260.9μg/g，无机硒含量100.22μg/g。

[0032] 实施例6 20吨罐发酵生产液体菌种：从斜面上挑一环菌接于10个装有200mL YPD培养基的三角瓶中，培养基中含有100 µg/mL的亚硒酸钠，30℃的条件下培养24h后，即为液体种子培养物。

[0033] 一级液体种子培养：将液体菌种按10-15%的接种量接于10个装有1500mL YPD培养基的三角瓶中，培养基中含有100 µg/mL的亚硒酸钠，30℃的条件下培养24h后，即为一级液体种子培养物。

[0034] 二级液体种子培养：将一级种子培养液按15-20%的接种量接入装有50升糖蜜含量4%，尿素含量0.5 %，磷酸含量0.4 %，100 µg/mL亚硒酸钠，pH值为6.0发酵培养基的100升发酵罐中，30℃的条件下，通气搅拌培养24小时，即为二级液体种子培养物。

[0035] 三级液体种子培养：将二级种子培养液按15-20%的接种量接入装有500升糖蜜含量4%，尿素含量0.5 %，磷酸含量0.4 %，100 µg/mL亚硒酸钠，pH值为6.0发酵培养基的1吨发酵罐中，30℃的条件下，通气搅拌培养24小时，即为二级液体种子培养物。

[0036] 发酵罐发酵培养：将三级种子培养液按15-20%的接种量接入装有10吨糖蜜含量4%，尿素含量0.5 %，磷酸含量0.4 %，100 µg/mL亚硒酸钠，pH值为6.0发酵培养基的20吨发酵罐中，30℃的条件下，通气搅拌培养48小时，期间，流加含有4 mg/mL亚硒酸钠的50%糖蜜补充碳源，氨水调pH值。

[0037] 收集酵母细胞及干燥：采用板框压榨或离心收集富硒酵母细胞。司班-60 2%，吐温-80 2%作为生产用保护剂，用单螺杆挤出造粒机造粒，流化床干燥器进风温度80℃干燥，水分小于6%。

[0038] 包装：用不透气的包装袋包装，即为含有高生物量的富硒酵母，每克干酵母含有机10
硒2800-3200μg/g，活菌数可达到6.5-8.0×10 CFU/g。

[0039] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。